Estudio del control genético de la patogénesis a través de la modificación de la cromatina en el hongo fitopatógeno Ustilago maydis

Abstract

Las infecciones fúngicas vegetales ocasionan la pérdida anual de toneladas de cultivos afectando, entre otros, a los cultivos más consumidos mundialmente, como el trigo, el arroz, la caña de azúcar, el maíz y la soja. La incidencia de este tipo de infecciones ha ido aumentando con los años, por lo que representan una amenaza cada vez mayor para la humanidad. Las infecciones fúngicas suponen una relación íntima entre el hongo y la planta en la que existe una comunicación constante entre los dos protagonistas. Por ello, el aumento del conocimiento sobre estas interacciones se convierte en algo crucial para combatir los problemas asociados con las enfermedades fúngicas.

Los hongos patógenos han desarrollado diversas estrategias para infectar y colonizar con éxito las plantas. Estas estrategias incluyen la formación de estructuras especializadas, como los filamentos infectivos o el apresorio, así como la secreción de proteínas efectoras que les permiten invadir los tejidos vegetales y evadir la respuesta inmune de la planta. Es esencial que todos estos procesos estén controlados cuidadosamente para que ocurran en el momento y lugar adecuados. Por lo tanto, para lograr una infección exitosa es fundamental que los programas genéticos que controlan estos procesos tengan una regulación transcripcional muy precisa.

Existen varios mecanismos de regulación transcripcional, entre los cuales, las modificaciones de la cromatina parecen ser especialmente importante para la regulación de la patogénesis fúngica. Las modificaciones post-traduccionales (PTMs) de las histonas pueden modular la estructura de la cromatina entre un estado transcripcionalmente activo (eucromatina) y un estado silenciado o de baja expresión (heterocromatina). En el hongo patógeno del maíz Ustilago maydis, se han perdido las proteínas canónicas encargadas de la formación de la heterocromatina en células eucariotas, como la proteína de heterocromatina 1 (HP1), el sistema de ARNi o las metiltransferasas que llevan a cabo la metilación de H3K9 o H3K27, dejando en incógnita cuáles son los factores implicados en la formación de heterocromatina en este organismo.

El objetivo principal de esta tesis doctoral es la búsqueda de los factores implicados en el establecimiento de regiones heterocromáticas en U. maydis, proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos implicados en la regulación génica a través de la formación de heterocromatina.

En el primer objetivo de la tesis se han estudiado las histona deacetilasas de Clase III, denominadas sirtuinas, ya que son las implicadas en la formación de regiones heterocromáticas en la levadura Saccharomyces cerevisiae, que comparte un escenario heterocromático similar a U. maydis. Mediante estudios de microscopía, se observó que Hst5 y Hst6 se localizan en las mitocondrias, Hst2 en el citoplasma, pero con una localización nuclear durante la división celular, y Hst4 y Sir2 en el núcleo. Dado que la deleción de hst4 resultó letal, nos centramos en el análisis posterior de Sir2.

La deleción de sir2 resultó en un ligero aumento de los tumores de las plantas infectadas en comparación con las infectadas con la cepa silvestre. Además, se observó que Sir2 está involucrado en el control del cambio morfológico que sufre el hongo en las primeras etapas del proceso infectivo, el paso de un estado no infectivo en forma de levadura a un estado infectivo en forma de filamento, detectándose un aumento en la longitud de los filamentos en el mutante ¿sir2. Adicionalmente, se detectó la disminución de los niveles de expresión de sir2, tanto a nivel transcripcional como traducional, durante la filamentación del hongo, sugiriendo un papel represor de Sir2 en dicho proceso. En consistencia con esta hipótesis, la inducción artificial de sir2 provocó una disminución en la formación de filamentos, así como una disminución considerable de los tumores de las plantas de maíz. Los análisis transcriptómicos realizados en este trabajo revelaron que el aumento de la filamentación causado por la deleción de sir2 viene acompañado por la sobreexpresión de genes requeridos durante dicho proceso. Por otro lado, y en concordancia con la disminución de los síntomas producidos en la planta por el mutante de sobreexpresión de sir2, la presencia de Sir2 durante el proceso infectivo produce la represión de un grupo específico de genes relacionados con el establecimiento del biotrofismo o la formación de tumores.

En lo que refiere a la función molecular de Sir2, aunque no se detectó ningún cambio significativo en los niveles de acetilación en ninguna de las histonas estudiadas, sí que se observó un aumento de la acetilación de la H4 al analizar de manera específica, mediante ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), algunos de los genes controlados por Sir2. Interesantemente, no se detectó un aumento en la acetilación de la histona H4K16 en estos genes, la típica modificación llevada a cabo por Sir2 en otros organismos, sugiriendo que podría deacetilar otros residuos de lisina de las histonas en U. maydis. Alternativamente, el aumento de la acetilación de la H4 en el mutante ¿sir2 podría ser el resultado de la inducción de los genes en lugar de ser la causa, ya que la transcripción génica lleva consigo la acetilación de las histonas. Esto podría sugerir que Sir2 controla la expresión de genes a través de un mecanismo que no implica la deacetilación de histonas.

Con el fin de indagar sobre el mecanismo de acción de Sir2, se llevó a cabo una inmunoprecipitación de Sir2 seguido del análisis por espectrometría de masas para identificar complejos o proteínas que interactúan con ella. En este análisis se encontraron proteínas que forman parte del complejo de la ARN polimerasa II y la maquinaria de replicación, así como un factor de transcripción descrito como un regulador de la filamentación del hongo.

Los resultados obtenidos en el primer objetivo indicaron que Sir2 no está implicado en el establecimiento de regiones heterocromáticas en este organismo, ya que no hemos encontrado un efecto transcriptómico relevante en las típicas zonas heterocromáticas como son los telómeros, los centrómeros o los clústeres de genes relacionados con la virulencia. Para continuar con la búsqueda de los factores encargados de este proceso, se procedió a investigar otro tipo de modificadores de histonas: histonas metiltransferasas de residuos de lisina (HKMTs).

Se identificó a UMAG_05327 como homólogo de Kmt1 (Clr4 en Schizosaccharomyces pombe), encargada de llevar a cabo la metilación en H3K9 y principal marca de heterocromatina constitutiva. Sin embargo, no se detectó esta marca histónica en los ensayos de Western Blot. De forma paralela, y con la misma metodología, se confirmó que los homólogos de Ash1 y Set2 identificados en U. maydis catalizan la metilación de H3K36. Los análisis de ChIP-seq realizados en este trabajo revelaron que la metilación llevada a cabo por Set2 se localiza en los ORF de la mayoría de los genes de U. maydis, coincidiendo con lo que se ha descrito sobre esta proteína en otros organismos. Esto sugiere que el papel de Set2 parece estar conservado en U. maydis, controlando la transcripción génica interaccionando con la ARN polimerasa II.

Por otro lado, la metilación de H3K36 mediada por Ash1 se localiza en zonas comúnmente heterocromáticas, como son los centrómeros y los clústeres de virulencia. Adicionalmente, se detectó que metila muchos de los genes esenciales durante el proceso infectivo. Mediante la realización de análisis transcriptómicos por RNA-seq en condiciones axénicas, se descubrió que los genes metilados por Ash1 se desreprimen en el mutante ¿ash1, indicando que esta HKMT mantiene estas zonas reprimidas durante las condiciones no patogénicas.

Finalmente, los ensayos de infección en las plantas del maíz revelaron un aumento de los síntomas de las plantas infectadas con el mutante ash1 y una disminución de los mismo en las plantas infectadas con el mutante set2. En concordancia con estos resultados, se observó un aumento en la filamentación del hongo en el mutante ash1 y una disminución de filamentos en el mutante set2.

Con estos resultados, proponemos a Ash1 como un factor implicado en la regulación de la patogénesis de U. maydis, probablemente a través del silenciamiento por heterocromatina de regiones como los clústeres de virulencia.