Estudio del ecosistema del biofilm de las aceitunas de mesa para su revalorización funcional

Abstract

La aceituna de mesa es el vegetal fermentado más importante de los países de la Cuenca Mediterránea, con una producción anual mundial en torno a los 3 millones de Tm/año. España se encuentra entre los mayores países productores, con casi un 20% de la producción mundial, lo cual genera aproximadamente >1.000 millones de euros/año al PIB de nuestro país. La mayoría de la producción nacional (>98%) se concentra en las comunidades de Andalucía y Extremadura. Durante los últimos años, y en proyectos previos y tesis doctorales desarrolladas en nuestro grupo de investigación, se ha podido demostrar la capacidad que ciertas especies de bacterias y levaduras autóctonas de las fermentaciones de aceitunas de mesa tienen para formar biofilms sobre la superficie de los frutos. Si somos capaces de dirigir el proceso fermentativo para que los biofilms que se formen contengan en su interior microorganismos beneficiosos, vamos a poder dotar a este vegetal fermentado de un mayor valor funcional, siendo una alternativa a los productos lácteos como ingesta de microorganismos probióticos. Sin embargo, aún queda mucho por conocer sobre la diversidad de microorganismos presentes en los biofilms, la genética de su formación, y sus aspectos más funcionales. La presente tesis doctoral se presenta como un compendio de publicaciones científicas, organizadas en 3 secciones y 13 capítulos. En la primera de las secciones (Capítulos 1-8) pretendemos profundizar en el estudio de la biodiversidad de microorganismos presentes en los biofilms de las aceitunas de mesa, con el objetivo principal de evaluar su seguridad alimentaria mediante la presencia o ausencia de géneros patógenos, así como el desarrollo de nuevos métodos que favorezcan su ruptura y posterior análisis metataxonómico. Así mismo, empleamos modelos de ML para discernir que especies bacterianas tienen una mayor predisposición a ser encontradas en los biofilms. En la segunda de las secciones (Capítulos 9-11), profundizamos en el estudio de los factores y genética que afectan al proceso de formación de biofilms, determinando por transcriptómica que genes se expresan en L. pentosus durante el proceso, así como la influencia que los principales compuestos fenólicos presentes en la aceituna tienen en el mismo. Finalmente, en la tercera de las secciones (Capítulos 12 y 13) profundizamos en el estudio de la funcionalidades y aspectos saludables que tanto el EPS como la cepa L. pentosus LPG1 formadora de biofilms tiene sobre células humanas y las propias personas, respectivamente. Por lo tanto, durante el desarrollo de la tesis se ha adoptado un enfoque multidisciplinar que integra cuatro líneas principales de investigación, aún no exploradas en conjunto en este campo, como son las ómicas, la IA, la seguridad alimentaria y ensayos clínicos. En la primera sección se llevaron a cabo diversos estudios sobre la biodiversidad microbiana presente en el biofilm de las aceitunas, tanto en muestras procedentes de fermentadores industriales como en muestras de aceitunas ya envasadas, así como de fermentaciones llevadas a cabo en planta piloto utilizando nuevos procesos tecnológicos (empleo de cultivos iniciadores, 1-MCP, etc.). A pesar de la gran cantidad de muestras analizadas, la frecuencia de aparición de géneros de patógenos alimentarios fue muy baja (<0.1%). En general, la inoculación condujo a una biodiversidad bacteriana más homogénea y mostró como esta fue cambiando a lo largo del proceso fermentativo. En cambio, la biodiversidad fúngica no se vio afectada por la inoculación inicial, aunque destacó por una mayor diversidad en la salmuera respecto al biofilm de las aceitunas. En el estudio de muestras de aceitunas ya envasadas con DOP Aloreña de Málaga, se encontró un aumento de la biodiversidad de las poblaciones bacterianas a lo largo de la vida de mercado del producto, así como una reducción de las poblaciones fúngicas. Sin embargo, la diversidad fue baja para ambos grupos microbianos. Por otro lado, se demostró que el uso del compuesto 1-MCP no afectaba a las comunidades microbianas encargadas de la fermentación y tampoco afecto a la formación normal del biofilm. También, en esta sección se evaluó, optimizó y validó un nuevo método para la extracción de los microorganismos del biofilm de la superficie de las aceitunas de mesa. Este nuevo método se basó en el bombardeo con esferas de vidrio la superficie de la aceituna, de este modo, se evitó la destrucción del fruto y con ello la menor liberación de ADN eucariota, lo cual mejoró el posterior análisis metataxonómico del biofilm. Las mejores condiciones de liberación fueron obtenidas con los parametras de 350 rpm, 15 minutros, 6 mm de diámetro de las esferas de vidrio y una ratio 0,16 gramos de esfera de vidrio por gramo de aceitunas. Así mismo, los recuentos de BAL y de levaduras liberadas fueron comparables a los obtenidos con el método control (stomacher). Este método fue validado en un estudio de la influencia de nuevos procesos tecnológicos, como aplicación de 1-MCP, DMDC y tratamiento térmico sobre la microbiota del biofilm de las aceitunas de mesa, llevado a cabo en escala de planta piloto. Los resultados muestran que los tratamientos empleados influyen sobre las especies de microorganismos presentes en el biofilm. Por último, se estudiaron diversos algoritmos de aprendizaje automático basados en ML para discernir que taxones bacterianos son las que están más asociadas al ecosistema del biofilm, mediante la clasificación de perfiles metataxonómicos de muestras procedentes tanto de biofilm como de salmuera. El modelo que dio mejores resultados fue el obtenido mediante el algoritmo RF con una precisión del 88 ± 2% y un valor para el índice kappa de 0,75. Además, mostró que los géneros Celerinatantimonas y Lactiplantiabcillus tienen una mayor predisposición a estar presentes en los frutos que en las salmueras. En la segunda sección se realizaron diferentes estudios para comprender tanto los mecanismos genéticos implicados en la formación del biofilm, como los factores ambientales. En primer lugar, se secuenció y anotó utilizando tecnología Illumina y PacBio el genoma de la cepa L. pentosus LPG1, aislada en anteriores estudios del biofilm de aceitunas de mesa, para evaluar su seguridad, funcionalidad y aspectos tecnológicos. El análisis de la cepa reveló L. pentosus LPG1 tiene un genoma de 3.700.533 de pares de bases, conformado por 1 cromosoma y 2 plásmidos, con un contenido en G/C de 46,34%. El estudio de sus 3.345 genes codificantes reveló que se trata de un microorganismo seguro y con elevado potencial probiótico y aplicación como cultivo iniciador para fermentaciones vegetales. A continuación, a través de un análisis transcriptómico se profundizo en los mecanismos genéticos de adaptación de la cepa L. pentosus LPG1durante la fermentación de aceitunas, así como la compresión de los mecanismos involucrados en la adherencia a la superficie del fruto durante el proceso de formación del biofilm. Un total de 64 genes estuvieron sobreexpresados. De este modo, se identificaron diversos genes (srtA, ywqD, ywqE, wbnH, lrgB y mreB) implicados en la adhesión y en la producción de EPS que estaban sobreexpresados en los biofilms. Por último, se realizó un estudio in vitro para evaluar la influencia de los compuestos fenólicos, encontrados más habitualmente en la fermentación de las aceitunas de mesa (oleuropeina, hidroxitirisol y tirosol), sobre la capacidad de formación de biofilm por diferentes cepas microbianas aisladas de aceitunas de mesa. Este estudio concluyó que los fenoles analizados no tuvieron influencia sobre las especies de levaduras estudiadas. En cuanto a las cepas de la especie L. plantarum, se observó una disminución en su capacidad de formación de biofilm cuando los fenoles estaban presentes. Por el contrario, para las cepas de la especie L. pentosus ensayadas, los efectos fueron dependientes de la cepa, donde la cepa L. pentosus LPG1 mostró un aumento en su capacidad de formar biofilm (x2) en presencia de bajas concentraciones de tirosol (50 ppm). En la tercera y última sección, se evaluó la funcionalidad de los componentes del biofilm (bacterias y EPS). Por un lado, se llevó a cabo un estudio clínico fase I con voluntarios sanos (n=39) con el fermento vegetal L. pentosus LPG1, donde se observó que la administración oral de este microorganismo logró modular y conservar mejor la microbiota intestinal, aumentando la abundancia de bacterias descritas como beneficiosas (Parabacteroides). Por otro lado, se evaluó la funcionalidad de extractos de EPS producidos por diversas cepas del género Lactiplantibacillus, todas ellas previamente aisladas de biofilms de aceitunas de mesa. Muchos de estos extractos mostraron propiedades antiinflamatorias y antioxidantes. Finalmente, se estudió la composición heteropolimérica del EPS producido L. pentosus LPG1, estando este compuesto por D-manosa (35,45 ± 2,02%), D-glucosa (32,99 ± 2,66%), L-arabinosa (17,93 ± 2,68%), D-xylosa (7,48 ± 3,74%), D-galactosa (4,03 ±0,45%), L-ramnosa (1,34 ± 1,34%) y D-fucosa (0,77 ± 0,77), y se modeló la producción de EPS por parte de la cepa LPG1 en función de diversas variables ambientales, obteniéndose una concentración máxima de 566,4 mg/mL en unas condiciones de temperatura (20ºCX), sal (7,0%) y pH (7,50). Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran que la aceituna de mesa en un alimento seguro, y qué al mismo tiempo, los fermentos que pueden llegar a formar biofilms sobre la epidermis del fruto tienen una elevada actividad probiótica y producen EPS con actividades funcionales. Podríamos incrementar aún más la carga de probióticos en la aceituna modificando la expresión de ciertos genes los cuales tienen una especial relevancia durante el proceso de formación del biofilm.