Desarrollo de sistemas de expresión para análisis metagenómicos funcionales e identificación de enzimas de interés

Abstract

La metagenómica es una disciplina que permite el estudio de los microorganismos a partir de su material genético, sin necesidad de cultivo previo. Presenta un potencial enorme de acceso a la gran fuente de recursos que supone la diversidad microbiana, debido a que más del 99 % de los microorganismos no son susceptibles de ser cultivados en condiciones de laboratorio.El material genético extraído de una muestra ambiental se clona en los vectores adecuados y se introduce en las bacterias hospedadoras seleccionadas, constituyendo las metagenotecas. Con ellas se pueden realizar análisis basados en secuencia, buscando secuencias que presenten homología con otras ya conocidas, y análisis basados en función, que permiten la detección de enzimas incluso completamente novedosas en clones que presentan un determinado fenotipo, seguido de la identificación posterior de los genes responsables. La principal limitación de la metagenómica funcional es la dificultad de la expresión del ADN metagenómico en hospedadores heterólogos.Para ello, en esta tesis se han desarrollado nuevos sistemas constituidos por vectores para la construcción de metagenotecas y bacterias especializadas para la realización de los rastreos, que conjuntamente permiten la inducción de la transcripción desde promotores heterólogos y la antiterminación de la misma, combinando elementos víricos y bacterianos. Uno de los sistemas está basado en la transcripción por la ARN polimerasa del fago T7, y el otro, en la transcripción por la ARN polimerasa bacteriana desde el promotor inducible por salicilato psal acoplado al sistema de antiterminación de la proteína N del fago lambda. Aprovechando el nuevo sistema se han construido dos metagenotecas de suelos contaminados y se han realizado con éxito búsquedas de distintas actividades de interés, como son la resistencia al antibiótico carbenicilina, oxigenasa hidroxilante de anillos aromáticos, dioxigenasa extradiólica, endoglucanasa y 13-glucosidasa. Por último, se han caracterizado clones portadores de algunas de estas actividades. Se puede destacar la identificación de una bomba de eflujo capaz de conferir resistencia a carbenicilina por sí misma, una gran cantidad de dioxigenasas extradiólicas muy diversas que han permitido el establecimiento de seis nuevas subfamilias y distintas monooxigenasas hidroxilantes. Algunas de estas últimas enzimas, forman parte de la ruta de desulfuración de dibenzotiofeno, que ha sido estudiada en más detalle.